PRODUZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI PROTEINE UMANE RICOMBINANTI E SAGGI DI FUNZIONALITA'

Durata: 28 ore

Programma

PRODUZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI PROTEINE UMANE RICOMBINANTI E SAGGI DI FUNZIONALITA'

 

MODULO UNICO: SSD: BIO/10

PERIODO DIDATTICO 1 SEMESTRE

PROF: SUSANNA COGOI

ORE:28

La proteina hnRNP A1 è in grado di svolgere la struttura a quadrupla elica nel promotore dell’oncogene KRAS regolandone la trascrizione (Paravisam M et al NAR 2009, vol 7 pagg 2841-53) e il tumore del pancreas dipende fortemente dall’espressione di KRAS per la sopravvivenza.

Obiettivo 1 (circa 14 h): Sintesi della proteina ricombinante hnRNP A1 in batteri BL21 trasformati. Estrazione e purificazione della proteina mediante colonna di affinità specifica.

Obiettivo 2 (circa 7 h): Determinazione spetrrofotometrica della concentrazione proteica con il metodo del blue Coomassie. Analisi qualitativa della proteina prodotta mediante separazione elettroforetica (SDS PAGE) e colorazione con blue Coomassie.

Obiettivo 3 (circa 5 h): Formazione della struttura a quadrupla elica di KRAS con sonda di DNA a singolo filamento marcata con Fluorescina e Rhodamina. Studio di funzionalità della proteina hnRNP A1 tale struttura mediante tecnica FRET (fluorescent resonance energy tranfer) con fluorimetro a piastra e mediante FRET melting con strumento per real time PCR.

Obiettivo 4 (circa 2h): Analisi dei dati.

 


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