PRODUZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI PROTEINE UMANE RICOMBINANTI E SAGGI DI FUNZIONALITA'
Durata: 28 ore
Programma
PRODUZIONE E CARATTERIZZAZIONE DI PROTEINE UMANE RICOMBINANTI E SAGGI DI FUNZIONALITA'
MODULO UNICO: SSD: BIO/10
PERIODO DIDATTICO 1 SEMESTRE
PROF: SUSANNA COGOI
ORE:28
La proteina hnRNP A1 è in grado di svolgere la struttura a quadrupla elica nel promotore dell’oncogene KRAS regolandone la trascrizione (Paravisam M et al NAR 2009, vol 7 pagg 2841-53) e il tumore del pancreas dipende fortemente dall’espressione di KRAS per la sopravvivenza.
Obiettivo 1 (circa 14 h): Sintesi della proteina ricombinante hnRNP A1 in batteri BL21 trasformati. Estrazione e purificazione della proteina mediante colonna di affinità specifica.
Obiettivo 2 (circa 7 h): Determinazione spetrrofotometrica della concentrazione proteica con il metodo del blue Coomassie. Analisi qualitativa della proteina prodotta mediante separazione elettroforetica (SDS PAGE) e colorazione con blue Coomassie.
Obiettivo 3 (circa 5 h): Formazione della struttura a quadrupla elica di KRAS con sonda di DNA a singolo filamento marcata con Fluorescina e Rhodamina. Studio di funzionalità della proteina hnRNP A1 tale struttura mediante tecnica FRET (fluorescent resonance energy tranfer) con fluorimetro a piastra e mediante FRET melting con strumento per real time PCR.
Obiettivo 4 (circa 2h): Analisi dei dati.
